产品目录

本制品是百奥莱博公司以探针法荧光定量PCR技术为基础开发的，专门用于副流感病毒5(PIV-5)型研究检测的试剂盒。

副流感病毒属于单链RNA病毒，包括许多知名的人类病毒和动物病毒。所有的副流感病毒都是通过呼吸道的传播途径进行传播，而且很多都能引起急性的疾病，并且具有非常强的传染性。其中副流感病毒5型可感染多个物种，比如：猴子、猪、猫、仓鼠、豚鼠等动物，也能感染人类。因此快速灵敏诊断具有重要意义。

1. 一站式，不需要单独准备每种成分，包括引物和对照。
   
2. 引物和探针经过优化，灵敏性高。
   
3. 特异性高，引物是根据副流感病毒5型高度保守区设计，具有良好的特异性。
   
4. 本制品足够50次20μL体系的探针法荧光定量RT-PCR反应。
   
5. 本制品只能用于科研。

1. 标记6个离心管，分别为6、5、4、3、2、1。
   
2. 用带芯枪头分别加入45μL荧光PCR专用模板稀释液(最好用带芯枪头，下同)。
   
3. 在6号管中加入5μL 1×10⁷拷贝/μL的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×10⁶拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
   
4. 换枪头，在5号管中加入5μL 1×10⁶拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10⁵拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
   
5. 换枪头，在4号管中加入5μL 1×10⁵拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10⁴拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
   
6. 重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品。放冰上用。

7. 如果有N个样品，最好设置N+2个提取，多出的一个是样品制备PC(样品制备阳性对照)，一个是样品制备NC(样品制备阴性对照)。可以用10μL阳性对照的10000倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为样品制备PC。另外用水作为样品制备NC。
   
8. 用自选方法纯化样品的RNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒RNA提取试剂盒兼容。

9. 如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照(用水做模板)，6个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做1次重复，则标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照(用水做模板)，1个用于PCR阳性对照(可直接用阳性对照的10000倍稀释液做模板)。下面只以定量分析为描述操作步骤，
10. 在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加):
    

    成分	样品管 N+2个	PCR阴性 对照管	PCR阳性对照管 (1～6管)
    探针法qRT-PCR缓冲液	10μL	10μL	各10μL
    探针法qRT-PCR酶混合液	2μL	2μL	各2μL
    副流感病毒5型探针法RT-PCR引物-探针混合液	3μL	3μL	各3μL
    待测样品RNA模板	5μL	-	-
    超纯水	-	5μL	-
    第7步所得标准曲线样品稀释液(1～6号)	-	-	各5μL

11. 盖上盖子后上机，按下面参数进行qRT-PCR：
    

    过程	温度	时间
    逆转录	45℃	10min
    预变性	95℃	10min
    PCR反应 (40个循环)
    	95℃	15sec
    	58℃	20sec(采集FAM通道的荧光信号)
    	60℃	30sec

12. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品RNA浓度的log值，再推算出其浓度。
    
13. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照Ct必须大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于35。对待测样品，如果其Ct大于或等于40则为阴性，如果小于或等于35则为阳性。如果在35～40之间，则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于40则为阴性，如果小于35，则为阳性。